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懸浮細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染操作

更新時(shí)間:2023-12-25點(diǎn)擊次數(shù):1092
  知道懸浮細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染操作有什么嗎?讓我們一起來看看吧!
  一、細(xì)胞轉(zhuǎn)染前的準(zhǔn)備
  1、細(xì)胞:
  貼壁生長細(xì)胞:一般要求在轉(zhuǎn)染前一日,必須應(yīng)用胰酶處理成單細(xì)胞懸液,重新接種于培養(yǎng)皿或瓶,轉(zhuǎn)染當(dāng)日的細(xì)胞密度以70-90%(貼壁細(xì)胞),最好在轉(zhuǎn)染前2-4 h換一次新鮮培養(yǎng)液。
  懸浮細(xì)胞:轉(zhuǎn)染前12-16 h進(jìn)行懸浮細(xì)胞傳代,傳代后適宜的細(xì)胞密度為20-40×104/mL。臺(tái)盼藍(lán)染色進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)保持活細(xì)胞比在95%以上。
  提前將293F細(xì)胞的密度調(diào)整至合適的密度后(2×106-4×106細(xì)胞/ml)于37℃搖床培養(yǎng)2-4 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。注意,參與轉(zhuǎn)染的細(xì)胞必須是培養(yǎng)三代或以上的穩(wěn)定細(xì)胞株。
  2、DNA:
  使用去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒,于生物安全柜/超凈臺(tái)用0.22μm濾頭過濾除菌。
  3、稀釋液:
  于生物安全柜/超凈臺(tái)用0.22μm濾頭過濾除菌。
  4、轉(zhuǎn)染試劑:
  轉(zhuǎn)染試劑如PEI溶液長期儲(chǔ)存于-20℃,不可反復(fù)凍融,溶液在4℃放置不超過一周。
  二、操作步驟(懸浮細(xì)胞)
  1、取一支已滅菌的Ep管,加入一定量的DNA,以相應(yīng)體積的300 mM NaCl稀釋,用槍頭混勻后靜置5 min;
  另取一支已滅菌的Ep管,加入相應(yīng)體積的300 mM NaCl稀釋對(duì)應(yīng)體積的PEI溶液用槍頭混勻后靜置5 min(稀釋液與DNA、PEI的總體積應(yīng)為轉(zhuǎn)染體積的5%)。
  將質(zhì)粒和PEI溶液混合,槍頭混勻后靜置一段時(shí)間,使DNA與PEI形成穩(wěn)定的聚合物。
  2、從搖床中取出293F細(xì)胞。用1 mL移液槍滴緩慢滴加轉(zhuǎn)染混合液,邊加邊搖晃搖瓶使轉(zhuǎn)染更加充分。
  3、轉(zhuǎn)染后將懸浮細(xì)胞置于搖床中培養(yǎng),條件為37℃、8%CO2、110 rpm。每隔24 h進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并用臺(tái)盼藍(lán)染色液觀察細(xì)胞的存活率。
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