在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，必須有可以貼附的支持物表面，其依靠自身分泌或培養(yǎng)基中的貼附因子才能在該表面生長(zhǎng)增殖的離體動(dòng)物的培養(yǎng)細(xì)胞。那么貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的步驟有那些呢？讓我們一起來(lái)看看吧！

1. 將含有凍存細(xì)胞的安瓿放入37℃水浴中解凍。

2. 用70%乙醇對(duì)安瓿的頂端進(jìn)行消毒，打開(kāi)安瓿，用吸管將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有5ml起始培養(yǎng)基的25cm2組織培養(yǎng)瓶中，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞均勻分布于培養(yǎng)瓶中，將其放入5%CO2加濕培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)過(guò)夜。

3. 吸出起始培養(yǎng)基，換成適當(dāng)?shù)木S持培養(yǎng)基。將細(xì)胞放回CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，每天檢查細(xì)胞是否生長(zhǎng)至匯片。

4. 如果細(xì)胞生長(zhǎng)至匯片，吸出培養(yǎng)基。

5. 用PBS或胰酶/EDTA清洗細(xì)胞，除去細(xì)胞上殘留的血清，將洗液吸出。

6. 用37℃、適當(dāng)體積的胰酶/EDTA剛好覆蓋單層細(xì)胞（如對(duì)于25cm2培養(yǎng)瓶需要0.3ml）。消化30～40s（細(xì)胞應(yīng)該分開(kāi)），晃動(dòng)培養(yǎng)瓶使細(xì)胞wan全分開(kāi)。

7. 加入1.4ml適當(dāng)?shù)木S持培養(yǎng)基，用吸管來(lái)回吹打細(xì)胞懸液多次以打散細(xì)胞團(tuán)（這些細(xì)胞用于傳代）。

8. 吸出0.5mL的細(xì)胞懸液，將其加入到新的含有30ml維持培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)瓶中。輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞均勻分布于培養(yǎng)瓶中，將其放入CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)直到細(xì)胞生長(zhǎng)至匯片（大約1周）。大約間隔一周用維持培養(yǎng)基進(jìn)行1:20稀釋傳代以維持細(xì)胞生長(zhǎng)。

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